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昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)

服務(wù)簡(jiǎn)介

昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (BEVS) 是一種利用桿狀病毒作為外源基因的載體,通過(guò)感染昆蟲(chóng)細(xì)胞或者昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)來(lái)表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng),是重要的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。

1.昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì):

a.桿狀病毒安全性好

b.攜帶外源基因的容量大

c.外源目的蛋白質(zhì)表達(dá)水平高

d.表達(dá)的真核基因產(chǎn)品可以進(jìn)行正確的折疊與修飾,因而具有良好的生物活性。

2.與哺乳細(xì)胞相比昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì):

a.培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單,不需要CO2

b.不容易被細(xì)菌污染

c.能進(jìn)行蛋白翻譯后糖基化修飾

d.大規(guī)模生產(chǎn)條件簡(jiǎn)單,更易獲得大量蛋白

常見(jiàn)的表達(dá)載體及特征

載體 特征
pFastBac1

用于高水平蛋白表達(dá)的強(qiáng)AcMNPV多角體基因 (PH)啟動(dòng)子

用于簡(jiǎn)化克隆的大型多克隆站點(diǎn)

pFastBacHT

用于高水平蛋白表達(dá)的強(qiáng)多角體(PH)啟動(dòng)子

用于使用金屬螯合樹(shù)脂純化重組融合蛋白的N端6His標(biāo)簽,以及用于在蛋白純化后去除6His標(biāo)簽的TEV蛋白酶裂解位點(diǎn)

用于簡(jiǎn)化克隆的三個(gè)讀碼框的載體

pFastBacDual

用于同時(shí)表達(dá)兩種蛋白的兩個(gè)強(qiáng)桿狀病毒啟動(dòng)子(PH 和 p10)

用于簡(jiǎn)化克隆的兩個(gè)大型多克隆位點(diǎn)

 

常見(jiàn)的表達(dá)細(xì)胞及特征

細(xì)胞 來(lái)源 用途
Sf9 Sf9細(xì)胞系克隆分IPLBSF21-AE(Sf21),來(lái)源于秋蠅蠕蟲(chóng)(草地夜蛾)蛹的卵巢組織

適于轉(zhuǎn)染、純化、生產(chǎn)高滴度病毒、鋪板以及表達(dá)重組蛋白

Sf21

Sf21細(xì)胞衍生于IPLBSF-21細(xì)胞系,也來(lái)源于秋蠅蠕蟲(chóng)(草地夜蛾)蛹的卵巢組織

也適于轉(zhuǎn)染、純化、生產(chǎn)高滴度病毒、鋪板以及表達(dá)重組蛋白。在一些結(jié)構(gòu)上Sf21細(xì)胞可能比Sf9細(xì)胞表達(dá)蛋白量高

Hi5

Hi5細(xì)胞系源于博伊斯湯普森研究所對(duì)植物的研究和源于白菜尺蠖卵巢細(xì)胞,粉紋夜蛾細(xì)胞

Hi5細(xì)胞表達(dá)重組病毒性能優(yōu)越, 經(jīng)常用于轉(zhuǎn)染和空斑純化,也適用于表達(dá)分泌型重組蛋白

S2

S2是一種果蠅晚期胚胎細(xì)胞。其中多為雌性四倍體細(xì)胞,也有雙倍體細(xì)胞

比較適合重組蛋白的表達(dá)

 

服務(wù)優(yōu)勢(shì)

1.普健生物利用經(jīng)典Bac-to-Bac技術(shù),打造了一個(gè)快速簡(jiǎn)便高效的桿狀病毒表達(dá)平臺(tái); 該技術(shù)能夠快速地產(chǎn)生重組病毒,而且不需要繁瑣的空斑分析,大大提高了效率。

2.蛋白生產(chǎn)的周期短,通量大??梢詫?shí)現(xiàn)細(xì)胞從小規(guī)模培養(yǎng)到大規(guī)模發(fā)酵的過(guò)程,使得蛋白產(chǎn)物甚至可以達(dá)到100mg/L的級(jí)別。

3.提供免費(fèi)的病毒粒子擴(kuò)增和儲(chǔ)存服務(wù),儲(chǔ)存期長(zhǎng)達(dá)2年。

服務(wù)內(nèi)容

服務(wù)項(xiàng)目

客戶提供

服務(wù)內(nèi)容

服務(wù)周期

交付內(nèi)容

昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)蛋白

基因序列

載體

基因合成及密碼子優(yōu)化

載體構(gòu)建

病毒包裝及擴(kuò)增

表達(dá)純化測(cè)試

放大生產(chǎn)及純化

服務(wù)報(bào)告

6-8 周

蛋白樣品

技術(shù)服務(wù)報(bào)告

案例展示

案例1 昆蟲(chóng)-桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)大蛋白A(272 KD)

  普健采用昆蟲(chóng)-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),C端融合6*His標(biāo)簽表達(dá)了大小為272 KD的蛋白A,經(jīng)過(guò)P1代表達(dá)測(cè)試,病毒擴(kuò)增后分別轉(zhuǎn)染Sf細(xì)胞和Tn細(xì)胞測(cè)定MOI,選取最佳表達(dá)條件進(jìn)行P2代表達(dá)測(cè)試和200ml表達(dá)純化,最終得到的蛋白A純度90%,產(chǎn)量5mg/L。

圖1 蛋白A P1代表達(dá)純化測(cè)試結(jié)果( 還原SDS-PAGE )
A.考馬斯亮藍(lán)染色. B. WB (ECL發(fā)光,抗His標(biāo)簽抗體).
ø.陰性對(duì)照培養(yǎng)基. 1 和 2.轉(zhuǎn)染的 1和2號(hào)克隆. Medium:培養(yǎng)基. NPE. 可溶上清. DPE. 沉淀. +. 陽(yáng)性對(duì)照.

 

圖2.蛋白A 在Sf 和 Tn 細(xì)胞中的P2 代表達(dá)測(cè)試(還原 SDS-PAGE).
考馬斯亮藍(lán)染色 Ø.陰性對(duì)照. D2-D3. 轉(zhuǎn)染后天數(shù). +. 陽(yáng)性對(duì)照.

 

圖3.蛋白A 在Sf 和 Tn 細(xì)胞中的P2 代表達(dá)測(cè)試情況-WB驗(yàn)證(還原 SDS-PAGE ).
Ø.陰性對(duì)照. D2-D3. 轉(zhuǎn)染后天數(shù). +. 陽(yáng)性對(duì)照.

 

圖4.蛋白A純化質(zhì)檢圖(還原 SDS-PAGE )
A.考馬斯亮藍(lán)染色. B. WB (ECL發(fā)光;抗His標(biāo)簽抗體). MW. 分子量標(biāo)記.

 

案例2 昆蟲(chóng)-桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體(蛋白B)

  普健生物采用昆蟲(chóng)-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),N端融合10*His和Flag標(biāo)簽表達(dá)了大小為42 KD的G蛋白偶聯(lián)受體-蛋白B(7次跨膜區(qū),2個(gè)糖基化位點(diǎn)),經(jīng)過(guò)P1代表達(dá)測(cè)試,病毒擴(kuò)增后分別轉(zhuǎn)染Sf細(xì)胞和Tn細(xì)胞測(cè)定MOI,選取最佳表達(dá)條件進(jìn)行P2代表達(dá)測(cè)試和200 ml表達(dá)純化,最終得到的蛋白B用biacore測(cè)定了跟配體的親和力,親和力在uM級(jí)。

圖1.蛋白B P2代表達(dá)純化測(cè)試(Sf和Tn細(xì)胞).
還原SDS-PAGE及考馬斯藍(lán)染色.
Ø.陰性對(duì)照.D2-D3.感染后天數(shù).
Medium:培養(yǎng)基.NPE.可溶性上清.DPE.沉淀.

 

圖2 P2代表達(dá)測(cè)試WB驗(yàn)證(Sf和Tn細(xì)胞;ECL發(fā)光法;抗His標(biāo)簽抗體).
Ø.陰性對(duì)照. D2-D3.感染后天數(shù).+.陽(yáng)性對(duì)照.Medium:培養(yǎng)基.NPE.可溶性上清.DPE.沉淀.

 

圖3 蛋白B純化質(zhì)檢圖(還原SDS-PAGE;考馬斯藍(lán)染色)
MW.分子量標(biāo)記.

 

圖4. 蛋白B跟配體親和力測(cè)定結(jié)果

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